Программирование неактивной РНК | Хэбэйская компания по производству автоматических выключателей постоянного тока, ООО

Nature, том 618, страницы 169–179 (2023 г.) Процитировать эту статью

26 тысяч доступов

248 Альтметрика

Подробности о метриках

Заселенность мишени часто недостаточна для проявления биологической активности, особенно в отношении РНК, что усугубляется давними проблемами, связанными с молекулярным распознаванием структур РНК небольшими молекулами. Здесь мы изучали закономерности молекулярного распознавания между коллекцией малых молекул, созданной на основе натуральных продуктов, и трехмерно свернутыми структурами РНК. Картирование этих ландшафтов взаимодействия в транскриптоме человека определило отношения структура-активность. Хотя ожидалось, что РНК-связывающие соединения, которые связываются с функциональными сайтами, будут вызывать биологический ответ, большинство выявленных взаимодействий были предсказаны как биологически инертные, поскольку они связываются в других местах. Мы пришли к выводу, что в таких случаях альтернативной стратегией модуляции биологии РНК является расщепление мишени посредством химеры, нацеленной на рибонуклеазу, где РНК-связывающая молекула присоединяется к гетероциклу, который связывается и локально активирует РНКазу L1. Наложение субстратной специфичности РНКазы L на ландшафт связывания малых молекул выявило множество подходящих кандидатов на связывание, которые могут быть биоактивными при превращении в деградеры. Мы обеспечиваем подтверждение концепции, разрабатывая селективные деградаторы предшественника связанной с заболеванием микроРНК-155 (пре-миР-155), мРНК JUN и мРНК MYC. Таким образом, деградация малых молекул, направленная на РНК, может быть использована для преобразования сильных, но неактивных связывающих взаимодействий в мощные и специфические модуляторы функции РНК.

Важность РНК в биологии здоровья и болезней хорошо документирована2, что дает возможность в рамках химической биологии изучать функции или вмешиваться в борьбу с дисфункцией соответственно. Нацеливание РНК на основе последовательности часто осуществляется с помощью комплементарных олигонуклеотидов, которые связываются с рибонуклеазой, а затем рекрутируют ее для расщепления мишени3. Этот метод лучше всего подходит для воздействия на неструктурированные области РНК, поскольку молекулярное распознавание происходит посредством спаривания оснований4. Однако РНК может быть высокоструктурированной, и ее биологическая функция часто определяется ее структурой5,6. Примечательно, что такие структурированные области поддаются нацеливанию путем связывания небольших молекул, которые взаимодействуют с карманами, представленными складкой РНК7. Однако заселения структур РНК только небольшими молекулами часто недостаточно для проявления биологического эффекта8.

Здесь мы разработали стратегию, которая превращает биологически неактивные РНК-связывающие небольшие молекулы в мощные и специфические эффекторы функции, достигаемая путем прикрепления элемента молекулярного распознавания РНК ко второму соединению, которое связывается и активирует рибонуклеазу для расщепления мишени. Наша задача состоит из трех задач: (1) определить взаимодействия связывания между малыми молекулами и складками РНК; (2) программируемым образом превращать высокоселективные связывающие взаимодействия, которые биологически инертны, в индукторы направленной деградации, создавая мощные и селективные функциональные ингибиторы; и (3) создать парадигму, с помощью которой небольшие молекулы могут устранять РНК.

Коллекция небольших молекул, подобных природным продуктам, с разнообразными свойствами9, состоящая из 15 000 членов, была исследована на предмет связывания с библиотекой трехмерных складок РНК, представленной в библиотеке внутренних петель 3 × 3 (ILL; исследовано 61 440 000 потенциальных взаимодействий связывания) (рис. 1a). ). 4096 уникальных складок РНК в 3 × 3 ILL включают внутренние петли 1 × 1, 2 × 2 и 3 × 3, а также выпуклые петли и полностью спаренные РНК. Связывание оценивали с помощью анализа замещения флуоресцентного красителя10, в котором соединения из библиотеки, которые связываются с РНК, вытесняют краситель и уменьшают его эмиссию. Первичная сортировка 15 000 малых молекул (10 мкМ) дала 1584 удачных соединения (расширенные данные, рис. 1a). Вторичная проверка 480 лучших соединений выявила 344 связывающихся малых молекул. Эти разнообразные соединения включают шесть РНК-связывающих каркасов, таких как 1-бензилиден-1-инден и фенотиазин (рис. 1б).

8. Preference for 3 × 3 internal loops and one-nucleotide bulges was collectively observed for these compounds. Of these 1,044 motifs, only 23 (2.2%) are present in highly expressed human transcripts (n = 2,712 total motifs), and 375 are new motifs with no previously known small-molecule binder. Inforna contains over 100,000 RNA–small molecule interactions and 6,453 unique RNA motifs of various types. d, Although around 6% of all miRNAs can be bound by C1–C6, only about 30% of targetable sites within them are functional (Drosha or Dicer processing site) and are therefore predicted to induce a biological effect. The other approximately 70% are unproductive interactions that are predicted to be biologically silent. We identified that 48% of miRNAs that have ligandable non-functional sites are potential substrates for RNase L, which could be targeted by RIBOTACs. Thus, biologically inert binders can be converted into bioactive RIBOTACs that provoke targeted degradation. Statistical significance referred to in c was calculated using two-tailed Student's t-tests./p> 8—a statistical threshold considered to be bound by the small molecule13—were analysed (n = 329 unique motifs; Fig. 1c). Notably, these compounds collectively showed a preference for 3 × 3 internal loops (78.4% bound by small molecules versus 48.3% in the initial library; P < 0.001) and one-nucleotide bulges (5.2% compared to 2.1%; P < 0.001; Fig. 1c). Among the 329 unique motifs, 258 had no known small-molecule binder. LOGO analysis of the RNAs in the top 0.5% of statistically significant enriched loops (Zobs > 8) revealed that each molecule binds to a unique RNA sequence pattern (Extended Data Fig. 2)./p> 8, among which 117 are new with no previously known small-molecule binders (Extended Data Figs. 4 and 5 and Supplementary Table 1). Combining these with motifs bound by C1–C6, this study contributes 375 new RNA motifs to the current database of RNA–small-molecule interactions. An analysis of the RNAs selected by the azolium salts revealed that the top three small molecules predicted to bind to the 5′GAU/3′C_A motif in pre-miR-155 were C19, C1 and C20, in rank order. Affinity measurements showed that only C1 and C20 bind to the A bulge of miR-155, while C19 binding was undetermined due to aggregation under assay conditions (Extended Data Fig. 3d). As observed for C1, C20 showed no saturable binding to an RNA with the A bulge changed to an AU pair (Extended Data Fig. 3d)./p> 1), with 1 upregulated and 28 downregulated. Notably, these 29 transcripts were also affected to a comparable extent by LNA-155 treatment (Extended Data Fig. 7i). When considering downstream targets of miR-155 predicted by TargetScanHuman (v.7.0)35 (n = 469), 307 (65%) were upregulated by pre-miR-155-RIBOTAC. A similar percentage (68%) of these 469 targets was also upregulated by LNA-155. Notably, 263 targets were upregulated by both pre-miR-155-RIBOTAC and LNA-155. A comparison of the normalized read counts for all genes between pre-miR-155-RIBOTAC and LNA-155 treatment showed a highly significant correlation, with R > 0.99 (Extended Data Fig. 7i). Collectively, these data indicate that pre-miR-155-RIBOTAC affects the transcriptome in similar ways to an oligonucleotide targeting miR-155 (LNA-155) and with limited off-target effects, although additional studies are needed to assess the selectivity of miRNA knockdown. Notably, pre-miR-155-RiboTAC selectively reduced miR-155 levels miRnome-wide in MDA-MB-231 cells forced to express wild-type pre-miR-155 but not those forced to express a binding site mutant (Extended Data Fig. 8a)./p> 50 µM) (Extended Data Fig. 10a). These data were corroborated by an orthogonal binding assay using Cy-5-labelled RNAs (Extended Data Fig. 10b). Target engagement was validated both in vitro and in the pancreatic cancer cell line MIA PaCa-2 (Extended Data Fig. 10c,d) using Chem-CLIP and its competitive variant. Finally, although in vitro binding assays and target validation confirmed engagement of the JUN IRES with JUN-binder, this molecule was biologically inert, with no effects on JUN mRNA or protein levels up to concentrations of 2 µM (Fig. 4c and Extended Data Fig. 10e)./p>

0.995 and cluster together. Compounds C12–C15 are nearly chemically identical as they share the cholesterol-derived azolium core, differing only by the other N-substituent. However, when compared to the remaining compounds (C1–C11 and C16–C20), their Tanimoto score ranges from 0.29–0.32, indicating they are unique among the hits obtained. C1 and C11 exhibit high similarity (Tanimoto coefficient = 0.82), although they appear very different structurally. This could be due to their similar spatial orientations, as both have alkyl substituted benzenes on their azolium cores. Compounds C4, C5, C6, and C20 are structurally unique compared to all other hits./p>